Catenibacterium mitsuokai通过结合肝细胞并产生喹啉酸促进肝细胞癌变的机制研究

近期，由中山大学附属第一医院携手香港中文大学组建的联合研究团队，于国际知名学术期刊《Cell Metabolism》发表了一项极具开创性的研究成果。该研究首次深度揭示了肠道细菌Catenibacterium mitsuokai（C. mitsuokai）在肝细胞癌（HCC）发生与发展进程中所扮演的关键角色，以及其背后具体的分子机制。

研究团队通过对HCC患者的粪便以及肿瘤组织展开细致的微生物学分析，意外发现C. mitsuokai在患者体内呈现出显著富集的现象。为进一步探究其作用机制，团队借助多种体内外实验模型展开深入研究。结果显示，C. mitsuokai凭借破坏肠道屏障完整性这一途径，以活菌的形态成功易位至肝脏。随后，它依靠自身表面蛋白Gtr1/RagA与HCC细胞上的γ1 - 连环蛋白受体紧密结合，进而实现在肝脏的定植。更为关键的是，研究发现C. mitsuokai所分泌的代谢产物喹啉酸（QA），能够直接与HCC细胞上的TIE2受体相结合，从而激活下游具有致癌性的PI3K/AKT信号通路，最终有力地推动了HCC的进展。这一研究成果不仅明确了C. mitsuokai作为HCC致病菌的直接因果关系，更为深入理解肠道微生物借助肠 - 肝轴参与肝癌发生的过程提供了全新的视角。

研究背景

HCC作为一种在全球范围内发病率和死亡率均位居前列的恶性肿瘤，其病因错综复杂。除了常见的慢性乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）感染之外，代谢综合征、非酒精性脂肪性肝炎以及肠道菌群失调等因素，也均被证实与HCC的发生密切相关。

肠 - 肝轴作为连接肠道与肝脏的关键生理通路，在肝脏疾病的发生发展过程中发挥着核心作用。当肠道菌群出现失衡时，肠道屏障功能便会受到损害，出现“肠漏”现象。这使得细菌及其代谢产物能够通过门静脉顺利进入肝脏，进而引发慢性炎症和肝细胞损伤，最终为肝癌的发生埋下隐患。

近年来，多项研究均发现HCC患者存在显著的肠道菌群紊乱情况，例如产脂多糖（LPS）的细菌数量增多，而益生菌的数量减少等。然而，具体是哪些细菌能够直接驱动肝癌的发生，以及它们通过何种机制发挥作用，目前尚未得到明确阐释。此前的研究大多聚焦于菌群代谢产物的间接作用，而对于细菌本身是否能够易位至肝脏并实现定植，以及与肝癌细胞直接相互作用的研究则相对匮乏。因此，鉴定与HCC相关的特异性致病菌，并深入阐明其致病机制，对于完善HCC病因学理论、开发新型诊断标志物以及制定有效的治疗策略，均具有重要的现实意义。

中山大学附属第一医院与香港中文大学联合研究团队，通过对HCC患者和健康人群的粪便及组织样本进行全面的菌群测序，成功筛选出差异富集的候选细菌。随后，通过一系列严谨的体内外实验系统，对该候选细菌的致癌作用及分子机制进行了全面验证，填补了肠道细菌直接驱动肝癌发生这一领域的研究空白。

研究结果

1. C. mitsuokai在HCC患者粪便和肿瘤组织中显著富集

为精准识别HCC中潜在的致病细菌，该研究对52名HCC患者的肿瘤组织和粪便，以及50名健康捐赠者的肝组织和粪便进行了16S rRNA测序。经过细致分析发现，链状菌属（Catenibacterium）在HCC患者的肿瘤组织和粪便中的含量均显著升高。而在Catenibacterium属中，唯一已知的潜在致病菌便是C. mitsuokai，它是一种存在于人类肠道中的革兰氏阳性厌氧菌。

值得注意的是，在36份粪便样本中，有12份（占比33.3%）检测到了C. mitsuokai；在38份肿瘤样本中，有5份（占比13.2%）检测到了该细菌。更为重要的是，有5名患者（占比13.2%）的粪便和肿瘤样本中同时鉴定出了C. mitsuokai，这一现象表明可能存在通过肠 - 肝轴的微生物易位。此外，与癌旁肝组织相比，C. mitsuokai在肿瘤组织中的富集程度更为显著。这些研究结果均有力地表明，C. mitsuokai是HCC中一个上调的潜在致病菌。

2. C. mitsuokai在多种HCC小鼠模型中促进肿瘤生长

为深入探索C. mitsuokai在HCC发展过程中的潜在功能，该研究精心建立了使用小鼠HCC细胞系RIL175的HCC原位小鼠模型。实验结果显示，与阴性对照组相比，经过C. mitsuokai处理的小鼠表现出了更强的生物发光强度，并且在实验终点时，肿瘤的重量和体积均有所增加。

为了进一步验证C. mitsuokai的促瘤作用，研究人员又使用了第二个原位HCC模型（小鼠Hepa1 - 6细胞）。同样，实验证实C. mitsuokai灌胃能够加速原位Hepa1 - 6肿瘤的生长，具体表现为生物发光强度增加，以及肿瘤重量和体积增大。

为了确定C. mitsuokai是否能够加速代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）相关的HCC的发展，该研究建立了营养性肝癌发生的STAM模型。结果发现，与对照组相比，接受C. mitsuokai灌胃的小鼠血清甲胎蛋白（AFP）水平显著升高，肿瘤数量、肿瘤体积以及最大肿瘤长度均显著增加。这充分表明，C. mitsuokai也能够促进MASH相关的HCC的发展。综上所述，C. mitsuokai可以在各种动物模型中有效促进HCC的进展。

3. C. mitsuokai通过至肝脏促进肿瘤发生并破坏肠道屏障

肠道屏障完整性对于阻止肠道细菌向肝脏迁移起着至关重要的作用。研究发现，C. mitsuokai灌胃能够显著增加常规小鼠和无菌小鼠的肠道通透性，具体表现为4kDa和500kDa FITC - 葡聚糖的肠道转运效率升高，同时门静脉中LPS水平也相应增加。

从机制层面分析，该细菌能够减少结肠黏膜中黏蛋白Mucin2的表达，从而破坏肠道黏液层的完整性；同时，它还会下调紧密连接蛋白E - 钙黏蛋白（E - cadherin）、闭合蛋白（occludin）和Claudin - 3的表达，导致肠道上皮细胞间的连接被破坏。透射电镜（TEM）进一步证实了肠道上皮紧密连接和黏附连接的结构出现了紊乱。

通过Cy5.5 - 赖氨酸标记细菌的体内示踪实验发现，Mitsuokai链状菌灌胃后，可在小鼠肝脏中检测到荧光信号，并且从肝脏组织中成功分离培养出了该细菌，这充分证实了其能够以活菌形式易位至肝脏。进一步分析表明，Mitsuokai链状菌主要破坏空肠、回肠和结肠的屏障功能，而对胆道、胃和十二指肠的屏障功能无显著影响，这提示其主要通过下消化道易位至肝脏。

4. C. mitsuokai表面蛋白Gtr1/RagA通过与HCC细胞上的γ - catenin结合促进其肝内定植

细菌在肝脏中的定植是其发挥致癌作用的前提条件。细胞黏附实验显示，C. mitsuokai对肝癌细胞（PLC5、Huh7）的黏附能力显著高于正常肝细胞（MIHA），TEM观察到细菌与肝癌细胞间形成了明确的病原体 - 宿主相互作用界面。

通过蛋白质谱分析，研究团队筛选出了C. mitsuokai的表面蛋白Gtr1/RagA。GST下拉实验和表面等离子体共振实验证实，该蛋白能够与肝癌细胞表面的γ - 连环蛋白（γ - catenin）直接结合，结合亲和力高达32.4nM，分子对接分析显示二者具有良好的结合构象。

功能验证实验表明，通过sgRNA敲低肝癌细胞中的γ - catenin后，C. mitsuokai对肝癌细胞的黏附能力显著降低，这充分证实了Gtr1/RagA - γ - catenin相互作用是该细菌在肝内定植的关键机制。

5. C. mitsuokai分泌QA激活TIE2/PI3K/AKT通路

为明确C. mitsuokai发挥致癌作用的效应分子，研究团队对细菌条件培养基（CM）进行了深入分析。结果发现，其对肝癌细胞的促增殖作用能够通过Transwell膜（物理隔离细菌与细胞）进行传递，并且经过加热或蛋白酶K处理后仍保留活性，这提示效应分子为非蛋白类小分子。

通过非靶向代谢组学分析，研究团队筛选出了在细菌CM、感染细菌的小鼠肿瘤组织和粪便中均显著富集的代谢产物——QA。

体外实验证实，QA能够浓度依赖性地促进肝癌细胞增殖和集落形成，加速细胞周期G1 - S期转换，同时抑制凋亡相关蛋白的表达。机制研究表明，QA能够与肝癌细胞表面的TIE2受体结合，激活下游PI3K/AKT信号通路，具体表现为p - TIE2、p - PI3K和p - AKT蛋白水平显著升高。通过sgRNA敲低TIE2或使用TIE2抑制剂，能够完全阻断QA和C. mitsuokai对肝癌细胞的促增殖作用以及PI3K/AKT通路激活。

体内实验进一步验证，在Hepa1 - 6细胞原位移植模型中，TIE2抑制剂能够显著逆转C. mitsuokai的促肿瘤作用，降低肿瘤体积和重量，同时抑制肿瘤组织中PI3K/AKT通路激活。这充分证实了QA - TIE2 - PI3K/AKT轴是该细菌致癌的核心机制。

研究结论

该项研究明确确定了C. mitsuokai是富集于HCC的一种致病菌。具体而言，C. mitsuokai通过破坏肠道屏障，以Gtr1/RagA - γ - 连环蛋白作为媒介，实现活细菌在HCC细胞的定植。同时，C. mitsuokai衍生的代谢物QA与酪氨酸激酶受体TIE2结合，驱动下游PI3K/AKT通路，从而有力地促进HCC的发展。

这项具有开创性的工作首次证明了C. mitsuokai通过破坏肠道屏障、使HCC细胞结肠化以及分泌QA激活下游TIE2/PI3K/AKT通路，进而促进HCC的进展。C. mitsuokai诱导肠道屏障功能失常，使其能够以活菌形式易位至肝脏，并在其中成功实现活菌定植。更为重要的是，C. mitsuokai分泌的QA作为致癌代谢物，激活TIE2/PI3K/AKT信号传导，为深入理解HCC中肠道微生物的作用机制提供了至关重要的见解。未来的研究将进一步验证C. mitsuokai在不同人群中的分布特征，并深入探索靶向TIE2通路对HCC患者的临床治疗价值。